מעבדה בשיטות הפרדה בניסוי זה נכיר ונתנסה במספר שיטות הפרדה בין חומרים 1. זיקוק 2. מיצוי 3. סינון 4. כרומטוגרפיה על שכבה דקה )TLC( חלק ראשון:זיקוק יין זיקוק הנו שיטה לטיהור נוזלים והפרדתם מתערובת. בזיקוק מרתיחים נוזל והופכים אותו לגז. מיד אחר כך מקררים את הגז ומעבים אותו בחזרה למצב הנוזלי. כאשר מחממים תערובת המכילה מספר נוזלים, הרכב האדים מעל התערובת יהיה עשיר במרכיבים הנדיפים )בעלי טמפרטורת רתיחה נמוכה(. דרך ההפרדה בתהליך הזיקוק מבוסס על כך שלכל נוזל ישנה טמפרטורת רתיחה מסוימת, המאפיינת אותו. לכן, אם נזקק תערובת בטמפרטורה הקרובה לטמפרטורת הרתיחה של המרכיב הנדיף, הרכב האדים מעל התערובת יכיל בעיקר מרכיב זה, והתזקיק המתקבל יכיל בעיקר אותו. בניסוי זה נזקק יין, אילו חומרים יש לדעתכם בתוך יין? בניית מערכת זיקוק הרכיבו בעזרת המדריך מערכת זיקוק, כפי שמתואר בתרשים א'. לתוך האביק הכניסו 25 מ"ל מי יין, וכמה אבני רתיחה. חברו את מערכת האידוי-עיבוי לברז מים. הדליקו בזהירות את הגזיות.
רשמו את הטמפרטורה בה מתחיל היין להזדקק: רשמו את תצפיותיכם, מה קורה בתוך מערכת הזיקוק: בתום הזיקוק, נבדוק האם האלכוהול שהזדקק מכיל מים. מה דעתכם? העבירו לתוך זכוכית שעון נקייה מעט מן האלכוהול שהתקבל בזיקוק, הוסיפו בעזרת ספטולה )כפית של כימאים( מעט אבקה,CuSO 4 והתבוננו בצבע האבקה. קבלת צבע כחול יעיד על הימצאות מים באלכוהול המזוקק. מה הצבע שהתקבל? חלק שני: מיצוי והפרדה של ליקופן וקרוטן מירקות מבוא ליקופן )המצוי בעגבניות ובפירות רבים( ו- β -קרוטן )המצוי בגזר ובכל העלים הירוקים( מיצגים פיגמנטים חומרי צבע טבעיים המשתייכים למשפחת התרכובות הקרוטנואידיות. ליקופן בנוי משרשרת ארוכה של 13 קשרים כפלים מצומדים )מערכת של קשר יחיד ולאחריו קשר כפול, לסירוגין(. ריבוי הקשרים המצומדים הוא המקנה לליקופן את צבעו האדום-כתום העז. הגיאומטריה סביב הקשרים הכפולים במערכת, היא גיאומטריה של טרנס, כפי שניתן לראות במבנה הליקופן.
מבנה מולקולת ליקופן β -קרוטן הינה מולקולה נפוצה מאד בעולם הצומח, אך חשיבותה העיקרית היא במערכת הראייה בעולם החי. β -קרוטן משמש פרו-ויטמין A, כלומר, חומר הבסיס ממנו מיצר הגוף החי ויטמין β -קרוטן A. הוא איזומר של הליקופן, בעוד שהליקופן בנוי משרשרת פחממנית מצומדת ארוכה, הרי שב- β -קרוטן ישנן טבעות משושות בשני קצוות השרשרת המצומדת, כפי שמתואר במבנה המולקולה המפורט בהמשך. השוני במבנה מסביר את הבדלי הצבע בין שתי המולוקולות: β -קרוטן בעל צבע צהוב. מבנה המולקולה β -קרוטן הקוטנואידים מסיסים בממימסים אורגניים, ולכן, תהליך הפקתם מן הירקות יבוצע על ידי מיצוי לממס אורגני. לאחר המיצוי תתקבל תמיסה אורגנית המכילה תערובת של מומסים, וביניהם ליקופן ו- β -קרוטן. הפרדת המומסים תתבצע באופן איכותי, בעזרת כרומטורפיה על שכבה דקה.)TLC( מיצוי אפשר למצות חומר מתערובת גולמית או מתמיסה, על ידי משיכתו לממס אחר, בתנאי שהממס אינו מתערבב בממס הראשון, שבתוכו נמצא החומר אותו מעוניינים להפריד. דוגמא נפוצה היא העברת חומר מתמיסה מימית לממס אורגני, תהליך זה נקרא מיצוי. כאשר התרכובת האורגנית )אותה רוצים להפריד( מסיסה הן במים, והן בממס אורגני, יש לטלטל אותה היטב בתערובת של שני הממסים )שאינם מתערבבים אחד בשני(, פעולה הגורמת להתחלקות
התרכובת בין שתי הפאזות, בפקטור חלוקה מסויים, האופייני לתערובת מים:ממס אורגני. למיצוי תרכובות אורגניות מתוך תמיסות מימיות בוחרים בממסים אורגניים המתאימים לתרכובת אותה רוצים למצות. למיצוי חומרים קוטביים )פולריים( משתמשים בממסים קוטביים, ולמיצוי חומרים לא-קוטביים משמשים בממסים לא קוטביים. על פעולת המיצוי חוזרים מספר פעמים עם כמויות קטנות של ממס. ד"ר מאירה שראל( )ההסבר לקוח מתוך החוברת "ניסויים בכימיה אורגנית" מאת עבודה במשפך מפריד המיצוי יוצא לפועל בעזרת משפך מפריד. מכניסים את התמיסה למשפך מפריד, ומוסיפים את הממס השני. סוגרים את המשפך בפקק ומטלטלים היטב, כאשר מידי פעם משחררים את הלחץ על ידי פתיחת הברז התחתון, כאשר הוא מופנה כלפי מעלה. במהלך הטלטול מוחזקים היטב במצב סגור הברז והפקק. לאחר גמר הטלטול נותנים למשפך המפריד להימצא במצב זקוף, כאשר הוא יושב בתוך טבעת ברזל והפקק העליון פתוח, ומחכים עד ששתי השכבות מופרדות באופן ברור. פותחים את הברז ומאפשרים לנוזל התחתון לרדת לתוך ארלנמייר. יש לשים לב ולזכור באילו מן השכבות נמצא החומר המבוקש! )ההסבר לקוח מתוך החוברת "ניסויים בכימיה אורגנית" מאת ד"ר מאירה שראל( כרומטוגרפיה כרומטוגרפיה היא שיטה להפרדה ולזיהוי מרכיבים בתערובת. הכרומטוגרפיה כוללת טכניקות רבות, ובכללותה היא מהווה כיום את הטכנולוגיה האנליטית הנפוצה ביותר, במחקר מדעי והן בתעשייה וברפואה. בשיטות כרומטוגרפיות ניתן להפריד תערובות עשירות מרכיבים לחומרים המרכיבים אותן. ורגישות
השיטה מאפשרת זיהוי והפרדה גם של חומרים המצויים בכמויות זעירות ביותר בתוך התערובת. הפשוטה בשיטות הכרומטרגפיה הנה כרומטורגפית הנייר, וכרומטוגרפיה על שכרב דקה.TLC - כאשר מטפטפים, לדוגמא, טיפת דיו במרחק מה מקצהו של נייר סופג )או פלטת,)TLC ומעמידים את הנייר בתוך כלי המכיל נוזל בתחתיתו )כך שכתם הדיו נמצא מעל לפני הנוזל אשר בכלי( מטפס הנוזל במעלה הנייר בשל כוחות נימיים )קפילריים(. הנוזל שמטפס במעלה הנייר מפריד את הדיו למרכיביה השונים, כיוון שהמרכיבים השונים נעים במהירויות שונות. לפיכך, נוצרת על פני הנייר סדרת כתמים אשר המרחק ביניהם הולך וגדל ככל שהזמן גדל. כל השיטות הכרומטוגרפיות מבוססות על עיקרון זה: קצב נדידה שונה של חומרים הנישאים על ידי זרימה קבועה של נוזל או גז דרך תווך הקבוע במקומו. התווך הקבוע מכונה הפזה הנחה, ואילו הנוזל או הגז הזורמים דרכו מכונים הפזה הנעה. קצב המעבר של חומר מסוים דרך הפזה הנחה נקבע על ידי חלוקתו בין שתי הפזות. כלומר, תלוי גם בכוחות הפועלים בין מולקולות החומר למולקולות הפזה הנחיית וגם בכוחות הפועלים בין מולקולות החומר למולקולות הפזה הניידת. בכרומטוגרפית הנייר, לדוגמא, תלויה מהירות תנועת חומר מסוים על פני הנייר בנטייה של מולקולות החומר להתמוסס בנוזל לעומת נטייתן להיקשר )להיספח( אל הנייר. ככל שחומר נספח חזק יותר אל הפזה הנחה, כך תהיה מהירות התקדמותו איטית יותר. וככל שמסיסותו של חומר בנוזל גבוהה יותר כל תהיה מהירות התקדמותו על פני הפזה הנחה גבוהה יותר.
החלוקה בין שתי הפזות תלויה, אם כן, ביחס בין שתי תכונות פיסיקליות. וההפרדה מבוססת על כך שלחומרים שונים תכונות פיסיקליות שונות, ולפיכך קבועי חלוקה ומהירויות נדידה שונים. ככל שקבועי החלוקה שונים יותר זה מזה, כך תהיה הפרדה טובה יותר. התכונות המעורבות בתהליך ההפרדה תלויות בטיבן של שתי הפזות. לדוגמא, כאשר הפזה הנחה עשויה מחומר קוטבי )פולרי(, היא קושרת אליה חזק יותר חומרים קוטביים )קשרים בין מולקולריים( ואלה נעים דרכה בקצב איטי יותר מחומרים שאינם קוטביים. קיימות שיטות כרומטוגרפיות רבות ושונות. השיטות השונות נקראות לעיתים על פי הפזה הנחה )כרומטוגרפית נייר,,TLC כרומטוגרפית עמודה(, או על פי הפזה הנעה )כרומטוגרפית גז,GC כרומטוגרפית נוזל.)HPLC השיטות השונות דורשות מכשור וציוד שונה, ומתאימות כל אחת לסוגי חומרים ספציפיים.
מהלך הניסוי מיצוי הקרוטנואידים מגזר או מרסק עגבניות שקלו בכוס כימית של 50 מ"ל כ- 5 גרם גזר מרוסק או רסק עגבניות הוסיפו לכוס 5 מ"ל של תערובת הממסים למיצוי )אצטון:הקסאן 1:1( ערבבו היטב את התערובת שנוצרה סננו דרך מסנן ביכנר )הניחו על המשפך נייר סינון בגודל מתאים( תוך שימוש במשאבה חיזרו על המיצוי עם שתי מנות נוספות של 5 מ"ל מתערובת הממסים הנ"ל שטפו את רסק הירק שנותר על גבי המסנן ב- מ 5 "ל נוספים של תערובת הממסים אספו את התסנינים משלושת המיצויים ואת תמיסת השטיפה אל כוס כימית נקייה של 50 מ"ל ניקוי התמיסה האורגנית וייבושה ממים העבירו את התמיסה האורגנית לתוך משפך מפריד בנפח 50 מ"ל הוסיפו 15 מ"ל תמיסת נתרן כלוריד רוויה ערבבו היטב את התמיסות והניחו למשפך לעמוד בטבעת המתאימה, עד להפרדת פאזות. מהי הפזה העליונה? מהי הפזה התחתונה? סלקו את הנתרן כלוריד שטפו את התמיסה האורגנית עם 15 מ"ל תמיסת 10% נתרן קרבונאט, וחזרו על פעולת ההפרדה שטפו שוב את הפאזה האורגנית, הפעם בעזרת 15 מ"ל מים וחזרו על פעולת ההפרדה
הוספו לתמיסה האורגנית מעט MgSO 4 לייבוש ( 4 MgSO הינו חומר היגרוסקופי סופח מים, אשר יספח את שאריות המים אשר נותרו בפאזה האורגנית( סננו את התמיסה לצורך סילוק ה-. MgSO 4 ביצוע כרומטוגרפיה בשכבה דקה בצעו הפרדה כרומטוגרפית על פלטת אלומינה, המיוחדת ל- TLC. עבור ליקופן טהור, β -קרוטן טהור והחומר אשר מיציתם. ציור 1 מציג את דרך הכנת הדוגמא. יש לצייר בעיפרון קו ישר במרחק 1.0 ס"מ מקצה נייר הכרומטורגמה. על גבי הקו יש להניח בעדינות נקודה קטנה מכל חומר שרוצים להריץ )בעזרת קפילרה(, ולרשום בעיפרון מהי כל נקודה, כפי שמודגם בציור 1. נייר הכרומטוגרמה נקודה של החומרים קו מצוייר בעיפרון, עליו להפרדה מניחים נקודה מכל דוגמא ציור 1: הכנת דוגמא להפרדה בשיטת TLC הפזה הנעה הינה תמיסת אתיל אצטט 2% בתוך הקסאן תמיסה A. מהי הפזה הנחה? לאחר גמר ההפרדה, סמנו את החומרים שהפרדתם על פלטת ה- TLC על פי תוצאות הכרומטוגרמה מה מכילה התערובת שמיציתם מן הירקות?